PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent

DNA transfection reagent for large scale recombinant protein expression and virus production

CatalogNumber：P09310

01/產品概述

　　PEI是基因轉染中常用的高分子載體，同時也是基因轉染的“金標準"。PEI轉染的原理是帶正電的陽離子聚合物與核酸中帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后，再與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，通過細胞胞吞進入細胞。PEI主鏈上每三個原子就含有一個氮原子，因此具有較高的陽離子密度，這對于結合帶負電荷的核酸分子是非常有利的。在生理pH條件下，PEI部分胺基被質子化，隨著體系pH值的降低，PEI剩余的胺基被質子化，從而賦予了其出色的核酸結合能力和質子緩沖能力，有利于通過質子海綿效應從內涵體逃逸。但是，PEI高的陽離子電荷密度，導致其嚴重的細胞毒性。同時，PEI25K含有4%-11％的殘留丙酰基，這可能阻礙聚合物主鏈與DNA的有效結合，影響基因轉染效率。因此，針對PEI的研究工作主要聚焦在通過功能化修飾以及脫丙酰基，來提高轉染效率、降低細胞毒性。

　　LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉染試劑是一種基于分子量25kDaPEI的DNA轉染試劑。通過對PEI進行功能改性，NEO-PEI丙酰基*脫落，顯著改善了PEI的基因遞送性能，表現出較好的穩定性和較低的細胞毒性。PolyShooterNEO-PEI與PEI25000轉染試劑相比，具有很多優點。包括：

　　1.PolyShooterNEO-PEI為即用型轉染試劑，無需配置，可直接用于細胞轉染實驗，而PEI25000需要先把水調成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH調至中性，配置過程繁瑣復雜，容易引入誤差導致轉染效果不穩定。PEI40000雖然較PEI25000更易溶解，但也同樣存在配置繁瑣，配置過程中容易引入誤差的風險。

　　2.PEI25000含有4%-11%的丙酰基殘留，丙酰基會阻止聚合物主鏈與DNA結合，影響轉染效果。相較于PEI25000，PolyShooterNEO-PEI丙酰基*脫落，因此其性能始終高效如一。

　　LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉染試劑是一種功能強大、值得信賴且經濟實惠的瞬時轉染試劑，廣泛適用于多種細胞系，包括HEK-293、HEK-293T、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH/3T3、Sf9、HepG2和HeLa細胞等。同時，PolyShooterNEO-PEI轉染試劑在大規模重組蛋白表達和病毒生產等領域有著高效、低毒、穩定、可靠等顯著優勢。PolyShooterNEO-PEI提供從96孔板到200L生物反應器持續的高表達轉染體系，實現從新藥研發到工業化生產的輕松過度。與大多數細胞轉染方案相比，使用PolyShooterNEO-PEI既能得到穩定的基因表達效率，又可顯著降低轉染成本；

02/產品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復凍融。

04/產品特點

　　易于使用——即用型轉染試劑，無需配置，可直接用于細胞轉染實驗

　　轉染效率高——針對多種類型細胞，均表現出優秀的轉染效率和高重組蛋白表達

細胞毒性低——作用溫和，能更好地實現高轉染效率與低細胞毒性之間的平衡

　　性能更穩定——丙酰基*脫落，性能始終高效如一

　　高性價比——既能得到穩定的基因表達效率，又可顯著降低轉染成本

　　化學成分明確，不含動物來源成分

05/適用范圍

PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent 廣泛適用于多種細胞系的DNA轉染，可應用于大規模重組蛋白表達和病毒生產等領域。本試劑提供從96孔板到200L生物反應器持續的高表達轉染體系，實現從新藥研發到工業化生產的輕松過度。

06/實驗流程概要

圖1: PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent轉染實驗流程圖

07/實驗步驟（以24孔板為例，其他培養板加樣體積參考表一：轉染量度標準）

1:準備待轉染細胞

　　貼壁細胞：轉染前一天，將消化后的細胞按照每孔0.3-2x10^5個細胞的量進行鋪板，使其在轉染時密度為60%-70%。

　　懸浮細胞：轉染當天，配制轉染試劑-核酸復合物之前，在24孔板中進行細胞鋪板，每500µL生長培養基中加入2-5x10^5個細胞。

　　?細胞狀態會極大影響轉染效率，待轉染細胞應處于良好生長狀態，建議使用生長處于指數期、存活率大于90%的細胞進行轉染。

2:準備PolyShooterNEO-PEI轉染試劑-核酸復合物

　　（1）取1μg質粒加入到1.5mL離心管中，加入2.5μL*PolyShooter NEO-PEI 轉染試劑與質粒混合，室溫孵育3分鐘。

　　?*PolyShooter NEO-PEI 轉染試劑使用量受細胞類型及其他實驗條件影響，通常情況下，DNA（μg）和PolyShooter NEO-PEI 轉染試劑（μL）的推薦使用比例為1：2.5。建議初次使用時，可在1：1-1：5的范圍內調整以優化轉染效果。

　　（2）往上述混合物中加入100μL無血清基礎培養基1（與培養體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉染試劑-核酸復合物。

　　?PolyShooter NEO-PEI 轉染試劑-核酸復合物在室溫下4個小時內保持穩定。

　　（3）30分鐘后，往轉染試劑-核酸復合物中加入150μL無血清基礎培養基2（與培養體系一致，且無血清無雙抗）稀釋復合物。

3:細胞轉染

　　棄去細胞培養基，將上述250µL轉染試劑-核酸復合物加入每孔細胞，轉染4-16小時后，給細胞補充新鮮生長培養基500µL/孔。

4:分析轉染細胞

　　轉染細胞培養36-48小時后，可根據實際情況用熒光檢測法、WesternBlot、RT-PCR、ELISA、流式細胞術、報告基因等檢測轉染效果，或加入篩選藥物進行穩定細胞株的篩選。

表一：轉染量度標準

08/注意事項

1:核酸質量：想要獲得最高的轉染效率和更低的細胞毒性，應選用高純度、無菌、無污染、無內毒素的優質核酸。質粒中的內毒素是轉染的大敵，內毒素會導致轉染效率顯著下降。推薦使用無內毒素質粒抽提試劑盒進行質粒提取，保證質粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時，需合理計算質粒用量，轉染過量的質粒可能會導致細胞毒性甚至死亡；

2:細胞質量：細胞狀態會極大影響轉染效率，建議使用生長處于指數期、存活率大于90%的細胞進行轉染；

　　3:細胞密度：建議細胞傳代后12-24h內、細胞密度為60%-70%時進行轉染。不同的細胞轉染實驗，對細胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細胞系的轉染時，需要根據說明書再次優化實驗條件。此外，在實驗過程中保證相同的接種條件，確保實驗數據的可重復性；

　　4:質粒與轉染試劑使用比例：對于大多數細胞系，轉染復合物中DNA(μg)與PolyShooteNEO-PEITransfectionReagent(μL)的比例在1：1至1：5之間，推薦比例為1:2.5。想要獲得轉染結果，需要對這一比例進行優化，根據所轉染細胞及質粒選擇適合的轉染比例；

　　5:PolyShooterNEO-PEITransfectionReagent也可用于有血清培養基的轉染，但通過我們實驗室的測試，我們認為體系中血清的存在會對轉染效果有一定程度的干擾，所以，為了追求更高效的轉染效率，我們更推薦使用無血清轉染法（即“07/實驗步驟"中敘述的轉染方法）；

　　6:由于一些特殊培養基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導的轉染，因此有必要檢測特殊培養基與PolyShooterNEO-PEITransfectionReagent的相容性；

　　7:為了您的健康安全，請規范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗；

　　8:本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

　　1:轉染前一天，將圖2所示3種狀態良好的細胞接種于24孔板，使其在轉染時密度為60%-70%。

　　2:按照每孔計量，取1μgGFP質粒加入到1.5mL離心管中，PolyShooterNEO-PEI組（圖2上）加入2.5μLPolyShooterNEO-PEITransfectionReagent與質粒混合，PEI組（圖2下）加入2.5μLPEI25k與質粒混合。室溫孵育3分鐘后，往混合物中加入100μL無血清基礎DMEM培養基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉染試劑-核酸復合物。

　　3:孵育30分鐘后，往轉染試劑-核酸復合物中加入150μL無血清基礎DMEM培養基稀釋復合物。

　　4:將細胞培養基棄去，加入上述250µL轉染試劑-核酸復合物。

　　5:轉染12小時后，給細胞補充新鮮生長培養基500µL/孔。

　　6:轉染細胞培養48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況，并拍照記錄，實驗結果如圖2所示。

圖2:轉染細胞48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況

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